Что такое инокуляция?
Инокуляция (от лат. inoculatio — прививка) — введение живых микроорганизмов в питательную среду, почву, организм животного или растения (то же, что «посев» в лабораторной практике и «заражение» — в сельском хозяйстве, медицине, биологическом эксперименте).В нашем случае, это введение спор в стерильный зерновой субстрат при помощи жидкой споровой взвеси.
В текущем разделе мы разберемся с основным и самым простым методом для начинающих — инокуляция зернового субстрата жидкой споровой взвесью в шприце.
Жидкая споровая взвесь — не самый быстрый метод с точки зрения зарождения мицелия в субстрате. Однако это самый простой и самый быстрый способ старта гровинга для начинающего шрумера. Именно этим методом мы воспользуемся в этом разделе. Отметим, что приготовление жидкой споровой взвеси это базовый навык культиватора, который понадобится и для других методов инокуляции.
Что нужно для инокуляции? Перечень материалов
Экипировка гровера: перчатки, медицинская шапочка, медицинская маска, медицинский халат (или полиэтиленовый дождевик).
Экипировка шрумера: перчатки, маска, шапочка, халат и ПЭТ дождевик
Банки со стерильным субстратом охлажденные до комнатной температуры.
Стерильный охлажденный субстрат в банках для инокуляции споровой взвесью
Жидкая споровая взвесь в шприце.
Жидкая споровая взвесь в шприце
Спирт в бутылке-спрей и/или во флаконе.
Этиловый спирт в бутылочке-спрей. Удобно использовать для дезинфекции во время микологических процедур
Антибиотик (гентамицин или аналог) — 1 мл на 10 мл споровой взвеси.
Гентамицин для споровой взвеси
Стерильные дышащие бактерицидные пластыри или микропора — по 1 шт. на каждую банку.
Дышащий бактерицидный пластырь или микропора
Стол, обработанный спиртом в чистой комнате. Ванная с плесенью на стенах, кухня, подвал, баня и т. п. не подойдут! Предпочти им обычную жилую комнату с плотно закрытыми окнами и дверями. В ней не должно быть сквозняков, кондиционирования и открытых вентиляционных каналов.
Нож для ампул или нож кухонный.
Ватные диски.
Свеча, зажигалка или спиртовка. Маркер.Зачем добавлять антибиотик в жидкую споровую взвесь перед инокуляцией?
Антибиотики (от др.-греч. ἀντί «против» + βίος «жизнь») — это противомикробные препараты, применяемые для лечения бактериальных инфекций. Они не действуют против вирусных и многих других инфекций и грибков. Антибиотики могут убивать микроорганизмы или останавливать их размножение, позволяя естественным защитным механизмам их устранять.Антибиотик оказывает бактерицидное действие. Он активно проникает через клеточную мембрану бактерий и тем самым угнетает синтез белка возбудителя. Таким образом, если бактерии попали во взвесь вместе со спорами со спорового отпечатка, то их можно подавить на ранних стадиях при помощи антибиотика. А также антибиотик дает запас прочности при попадании спор в субстрат с наличием жизнеспособных бактерий. Применение антибиотика позволяет снизить риск развития бактериального заражения на этапе колонизации зернового субстрата.
️ Антибиотик добавляется за 20-30 минут до инокуляции. Передерживать взвесь с антибиотиком или превышать дозировку не рекомендуется. Ведь помимо того, что он воздействует на конкурирующие микроорганизмы он может радикально подействовать на споры псилоцибиновых грибов. Если же прошел час или два, ничего страшного — продолжай, нужные споры довольно живучи.️ Но хотим тебя предупредить о том, что антибиотик может на несколько дней затормозить появление мицелия. Поэтому не беспокойся, если не увидишь зачатки мицелия на 4-6 день, он может появится к 10-14 дню.
Однажды у нас был вынужденный эксперимент и пришлось оставить антибиотик во взвеси на 3 часа. Это никак не повлияло на споры и скорость развития мицелия.Подготовка к инокуляции и добавление антибиотика во взвесь
Тщательно помой руки с мылом до локтей и умой лицо. Надень на себя экипировку: медицинскую маску, шапочку, медицинский халат (или полиэтиленовый дождевик). Обработай спиртом руки в перчатках. Тщательно втирай спирт по всей поверхности перчаток. Обработай спиртом рукава до локтя и всю поверхность стола. Обработай спиртом все, что находится у тебя на столе: банки с зерном, ампулу с антибиотиком, нож, шприц со взвесью и даже флакон со спиртом. Спирт не жалей! Открой ампулу/флакон с антибиотиком. Шприцем со взвесью втяни антибиотик из расчета: 1 мл антибиотика на 10 мл жидкой споровой взвеси. Измерять легко и удобно с помощью делений на шприце. Закрой колпачок шприца. Тщательно взболтай взвесь, чтобы антибиотик распределился равномерно. Оставь шприц с антибиотиком на 20-30 минут. По истечении 20-30 минут можешь разбавить взвесь как это было описано в предыдущем разделе Споровая взвесь или сразу приступай к инокуляции.Пошаговый процесс инокуляции
Обработай всё спиртом еще раз: руки, стол, шприцы, банки.
Подготовка к инокуляции жидкой споровой взвеси в стерильный зерновой субстрат
Удобно использовать спирт в бутылке-спрей. Можешь просто перелить имеющийся спирт в такую бутылку.
Поставь перед собой банку со стерильным субстратом. Сними с неё фольгу. Пластырь на крышке НЕ трогай и НЕ снимай! Обработай спиртом банку с субстратом и инокуляционный порт на крышке. Возьми шприц со взвесью и взболтай её, чтобы споры равномерно распределились в воде. Сними колпачок со шприца. Зажги зажигалку/спиртовку или свечу. Кончик иглы шприца раскали над огнём до красноты.
Дезинфекция иглы шприца со взвесью над огнем перед инокуляцией
Иглу шприца раскалить над пламенем до красноты
Опусти иглу в спирт и/или протри иглу ватным диском, смоченным в спирте. Это делается не только для дезинфекции, но и чтобы остудить иглу.
Опусти иглу шприца со споровой взвесью в спирт
Протри иглу шприца ватным диском смоченным в спирте
Введи иглу шприца в инокуляционный порт (сквозь пластырь). Влей взвесь (1 мл в каждую банку) по кругу банки для равномерного распределения по субстрату или по стенкам банки. Следи, чтобы кончик иглы НЕ касался зерна!
Процесс инокуляции жидкой споровой взвеси psilocybe cubensis
Достань шприц из банки. Обработай иглу спиртом и надень защитный колпачек. Место прокола (инокуляционный порт) как можно быстрее заклей сверху внахлест еще одним дышащим бактерицидным пластырем. Если инокуляционный порт из бутилкаучука, то заклеивать пластырем не нужно. Слегка потруси банку в горизонтальной плоскости, чтобы споры равномерно распределились по верхнему слою субстрата. Подпиши штамм грибов на банке, дату инокуляции, свои особые отметки, эксперименты.
Будь осторожен с огнем и спиртом. Соблюдай пожарную безопасность! Повтори процедуру инокуляции с каждой последующей банкой с субстратом и споровой взвесью.
Перед каждой инокуляцией не забывай дезинфицировать иглу шприца спиртом и над огнем.
Теперь все чудо-банки после инокуляции нужно поместить в совсем темное, теплое (+27°..+29°C) и сухое место. Для этого понадобится организовать инкубатор. В нём мицелий будет наслаждаться своей вегетативной фазой и сожрёт всё на своём пути.
Какие существуют методы инокуляции?
Помимо жидкой споровой взвеси есть более эффективные, но трудоемкие и времязатратные методы инокуляции. Коротко рассмотрим особенности и преимущества каждого из них.
Жидкая культура (жидкий мицелий или жидкая грибница).Новички часто путают Жидкую споровую взвесь и жидкий мицелий. Но это не одно и то же!
Составляющими для приготовления жидкой культуры являются жидкая споровая взвесь и питательная среда (например, на основе мёда или декстрозы), в которой начнет своё развитие мицелий.
Жидкая грибница обладает более высокой жизнеспособностью, чем споровая взвесь. Из нее можно приготовить много сырья, размножив её в питательных растворах. Процесс колонизации субстрата при инокуляции жидкой культурой стартует на несколько дней быстрее и развивается активнее.
Но процесс приготовления жидкой грибницы более трудоёмкий и требует времени для развития мицелия в жидкой питательной среде.
Кусочком зернового маточника (трансфер зерна или инокуляция «зерно в зерно»). Этот метод требует определенной стерильности. Желательно использовать SAB (still air box).Процесс колонизации зерна будет быстрый и активный. Но для реализации этого метода уже должен быть в наличии субстрат обросший мицелием (зерновой мицелий).
Кусочком агара, обросшим мицелием. Для этого нужно предварительно подготовить питательную стерильную среду на основе агара с мальтозой или декстрозой и сперва инокулировать её. Агар с декстрозой — наиболее широко используемая среда для выращивания грибов и бактерий.А инокуляция самого агара осуществляться:
непосредственно спорами из спорового отпечатка жидкой споровой взвесью жидкой культурой путем трансфера агара с мицелием в новую стерильную чашу с агаром путем трансфера нескольких зернышек зернового мицелия на агар путём клонирования плодового тела гриба.С помощью агара можно выявить сегментацию разных типов роста мицелия (ризоморфный и войлочно-опушенный), осуществлять селекцию, улучшение штаммов и выделять чистые штаммы из мультиспоры.
Такие процессы требуют идеальных стерильных условий, определенных навыков и понимания базовых микологических принципов. Все эти методы должен попробовать и освоить каждый уважающий себя культиватор для выхода на новый уровень выращивания грибов. Причем это касается не только псилоцибиновых грибов, но и деликатесных и медицинских грибов: кордицепс, ежовик гребенчатый, рейши, майтаке и другие.